為了保證分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，必須對(duì)所采用的分析方法的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可行性進(jìn)行驗(yàn)證，以證明分析方法符合檢測(cè)的目的和要求，這就是分析方法驗(yàn)證。從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過(guò)設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證所采用的分析方法符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。方法驗(yàn)證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測(cè)，方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方法驗(yàn)證內(nèi)容包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測(cè)目的不同驗(yàn)證要求也不盡相同。
1.專屬性
專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開(kāi)的特性，也稱為選擇性。對(duì)于純度檢測(cè)，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對(duì)于過(guò)程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來(lái)考察有沒(méi)有其它的雜質(zhì)干擾。必要時(shí)使用二極管陣列檢測(cè)器或者質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。
2.線性
線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測(cè)的基礎(chǔ)，需要定量檢測(cè)的項(xiàng)目都需要驗(yàn)證線性。一般用貯備液經(jīng)過(guò)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測(cè)物質(zhì)的濃度（5個(gè)以上），按濃度從小到大運(yùn)行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用zui小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，考察分析方法的線性。
3.范圍
范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時(shí)，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡(jiǎn)單的說(shuō)，范圍就是分析方法適用的樣品中待測(cè)物的濃度zui大值和zui小值。需要定量檢測(cè)的分析方法都需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，純度檢測(cè)時(shí)，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80％～120％。
4.準(zhǔn)確度
準(zhǔn)確度是指測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度，所以也叫做真實(shí)度，需要定量得分析方法均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對(duì)于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定，必要時(shí)可與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。
5.精密度
精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，取樣檢測(cè)次數(shù)應(yīng)至少6次。
精密度可以從三個(gè)層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。
a、重復(fù)性是在相同的操作條件下、較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
b、中間精密度：同一實(shí)驗(yàn)室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時(shí)，測(cè)定結(jié)果的精密度。
c、重現(xiàn)性：指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。
6.檢出限
檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的zui低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測(cè)定可以通過(guò)對(duì)一系列已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行檢測(cè)，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測(cè)物的zui小濃度來(lái)確定，也可把已知濃度樣品的信號(hào)與噪聲信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時(shí)的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。
7.定量限
定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測(cè)的zui低量，其測(cè)定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測(cè)的能力。檢測(cè)需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來(lái)確定定量限。
8.耐用性
耐用性是指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動(dòng)因素包括：流動(dòng)相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法有效。
9.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
液相色譜分析方法主要依賴液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗(yàn)證時(shí)，有必要將液相色譜儀、色譜柱、流動(dòng)相與實(shí)驗(yàn)操作、待測(cè)樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的指標(biāo)。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：分析方法能夠達(dá)到0.05%的檢出限，主峰的拖尾因子0.5<Tf<2.5，主峰與雜質(zhì)的分離度大于2.0，空白干凈，主峰處無(wú)系統(tǒng)峰干擾。
分析方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證是一個(gè)整體，在實(shí)際工作中，一般是先開(kāi)發(fā)分析方法，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗(yàn)證，驗(yàn)證的部分內(nèi)容在分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)就要做，比如說(shuō)分析方法的專屬性驗(yàn)證。分析方法驗(yàn)證并非必須驗(yàn)證所有的內(nèi)容，只要注意驗(yàn)證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測(cè)一般只需要驗(yàn)證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，則不需要驗(yàn)證。
有時(shí)需要對(duì)分析方法進(jìn)行全面或部分的再驗(yàn)證。當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生改變時(shí)，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法的專屬性就需要再進(jìn)行驗(yàn)證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測(cè)新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對(duì)主成份的含量測(cè)定應(yīng)無(wú)干擾。當(dāng)分析方法發(fā)生部分改變時(shí)，如檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生改變，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗(yàn)證，以證明改變后的分析方法的合理性、可行性。
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