1實(shí)驗(yàn)部分
1.1材料、儀器及試劑
供試材料16個(gè),由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所提供,其中穩(wěn)定的品種及品系材料13個(gè),分別為中油821、1008、5899、6098、M1、R1、R6、168、H8003、8908、8007、TR008和Y001,F1代材料3個(gè)分別為6098/1008、6098/M1和5899/1008。薹期取10個(gè)單株第3、4片新葉混合,保鮮袋密封保存于-45°C低溫冰箱冰凍干燥20h,貯存于-40°C低溫冰箱備用。
MODULOD2230冰凍真空干燥儀;電熱鼓風(fēng)熱干燥箱;DW2FL135低溫冰箱;KQ2800KDE型超聲波清洗器和SigmaZK15冷凍離心機(jī)。waters液相色譜系統(tǒng),510型梯度泵,470型自動(dòng)進(jìn)樣器,2487型紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)229nm,NovapakC18色譜柱,柱溫30°C,進(jìn)樣量10μL,流動(dòng)相流速為1mL/min,洗脫液為100%水-20%乙腈梯度洗脫。
實(shí)驗(yàn)所用試劑均為色譜純,丙烯基硫甙和苯甲基硫甙標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)自Sigma公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1葉片硫甙含量計(jì)算
根據(jù)慣例測(cè)定結(jié)果采用丙烯基硫甙或苯甲基硫甙作為色譜內(nèi)標(biāo)物根據(jù)保留時(shí)間對(duì)硫甙進(jìn)行定性、定量,以每克葉片干粉所含硫甙微摩爾數(shù)表示(μmol/g),硫甙分量計(jì)算公式如下:
式中,G.硫甙分量;Ag.脫硫硫甙峰面積的數(shù)值;As.標(biāo)準(zhǔn)脫硫硫甙峰面積的數(shù)值;Kg.脫硫硫甙相對(duì)校正系數(shù);m.試樣質(zhì)量的數(shù)值,單位為g;n.加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量,單位為μmol。
1.2.2樣品前處理方法
分別采用液氮、電熱鼓風(fēng)熱干燥和冰凍干燥3種不同方法處理供試材料,確定試驗(yàn)*的干燥方法。
準(zhǔn)確稱取01200g粉碎樣品于10mL聚丙烯圓底離心管中,75°C水浴殺活1min,加70%(φ)甲醇2mL,內(nèi)標(biāo)200μL(不含丙烯基的樣品加丙烯基為內(nèi)標(biāo),否則加苯甲基為內(nèi)標(biāo))渦旋混合,分別用超聲波提取、75°C水浴提取和高速旋轉(zhuǎn)勻漿機(jī)3種提取方式進(jìn)行提取。
1.2.3HPLC色譜條件
本實(shí)驗(yàn)采用液相色譜分離梯度洗脫。流動(dòng)相A:100%水;流動(dòng)相B:20%乙腈。0～10min,A為85%～0;10～12min,A為0;12～15min,A為0～85%。流速1mL/min。
1.2.4葉片硫甙回收率和方法精密度實(shí)驗(yàn)
用高、中、低硫甙3種甘藍(lán)型油菜葉片進(jìn)行苯甲基硫甙標(biāo)準(zhǔn)樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。對(duì)油菜葉片樣品進(jìn)行10次重復(fù)測(cè)定,計(jì)算極差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,確定油菜葉片測(cè)定方法的精密度。
2結(jié)果與討論
2.1葉片樣品干燥前處理方法與檢測(cè)結(jié)果
油菜葉片為鮮活樣品,其硫甙含量與組分分析有特殊性,與種子中硫甙測(cè)定不同,當(dāng)油菜葉片組織被機(jī)械損傷或受到病蟲害侵襲時(shí),可引起葉片硫甙含量急劇變化。實(shí)驗(yàn)分析了液氮、加熱干燥和冰凍干燥3種方法對(duì)油菜葉片中硫甙含量測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果表明:液氮處理樣品的測(cè)定結(jié)果較好,但操作復(fù)雜,不適用于大批量樣品分析。加熱干燥處理樣品過(guò)程中因部分硫甙降解,造成測(cè)定結(jié)果偏低。冰凍干燥測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,檢測(cè)靈敏度高,分析效率高,可操作性強(qiáng),適于批量樣品處理分析。因此實(shí)驗(yàn)采用冰凍干燥方法進(jìn)行油菜葉片樣品前處理。
2.2葉片硫甙提取技術(shù)與檢測(cè)結(jié)果
以超聲波、75°C水浴和高速旋轉(zhuǎn)勻漿機(jī)不同的提取硫甙方式進(jìn)行提取效率比較,結(jié)果見(jiàn)表1。由結(jié)果可以看出:水浴方法提取時(shí)間較長(zhǎng),且硫甙含量的測(cè)定結(jié)果偏低;高速旋轉(zhuǎn)勻漿機(jī)提取使結(jié)果顯著低于其它兩種提取方式;超聲波提取具有提取率高、時(shí)間短、對(duì)提取成分影響小、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),用于油菜葉片中硫甙的提取,可以節(jié)約分析時(shí)間,簡(jiǎn)化操作,提高工作效率。
2.3葉片硫甙含量的加標(biāo)回收率
選取葉片硫甙含量不同的甘藍(lán)型油菜樣品,添加苯甲基硫甙標(biāo)準(zhǔn)樣品,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。不同葉片硫甙總量水平下,分別加入015、510和1010μmol標(biāo)準(zhǔn)樣品,油菜葉片硫甙加標(biāo)回收率均達(dá)94%以上,且結(jié)果穩(wěn)定,回收率變化范圍為94%～103%,表明該方法準(zhǔn)確可靠。
2.4方法精密度實(shí)驗(yàn)
對(duì)相同油菜葉片樣品10次重復(fù)處理。測(cè)定均值為8138μmol/g,極差為2129μmol/g。每個(gè)樣品值與均值之偏差均小于2μmol/g,極差小于3μmol/g,誤差在油菜種子硫甙測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)(ISO9167:1-1992)規(guī)定范圍之內(nèi),RSD為8112%,表明該方法重復(fù)性較好。
2.5不同油菜葉片硫甙含量與成分分析
用建立的油菜葉片硫甙總量與分量測(cè)定方法,對(duì)芥菜型、白菜型和甘藍(lán)型油菜薹期葉片進(jìn)行分析,具體結(jié)果見(jiàn)表3及圖1～3。
不同類型油菜品種,其薹期葉片硫甙含量不同,各組分在3類油菜葉片中差異很大。芥菜型油菜葉片僅含有丙烯基硫甙和32丁烯基硫甙兩種組分,但含量較高,分別為8196μmol/g和5140μmol/g;白菜型油菜葉片主要含32丁烯基硫甙、32吲哚甲基硫甙和42戊烯基硫甙,且3種組分含量都較低,分別為0130、1179和0125μmol/g;甘藍(lán)型油菜葉片含較多硫甙組分,其中以22羥基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和吲哚類硫甙為主,含量分別為7121、4103和2169μmol/g。
前人研究結(jié)果表明，油菜種子中硫甙芥菜型以丙烯基硫甙為主;白菜型以32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙為主;甘藍(lán)型以22羥基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙為主?？梢?jiàn),不同類型油菜中,葉片硫甙與種子硫甙的主要組分不盡一致,關(guān)于兩者之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)油菜葉片硫甙與組份測(cè)定HPLC方法的建立,為油菜定向雜交育種與抗性品種選育提供了檢測(cè)手段支持。
在線咨詢