忍冬的花和藤均為藥用部位，并被《中華人民共和國(guó)藥典》所收載。而忍冬的葉子被視為金銀花和忍冬藤的副產(chǎn)物，產(chǎn)量雖然較高，卻一直被視為非藥用部位而未得到充分開發(fā)利用，造成資源浪費(fèi)。為此，本文進(jìn)一步研究了金銀花、忍冬新葉及忍冬老葉之間成分含量的差異，為忍冬葉藥用價(jià)值的開發(fā)提供參考。
1實(shí)驗(yàn)部分
1．1儀器與試劑
液相色譜儀(Agilent1220，包括四元泵及VWD紫外檢測(cè)器;Agilent公司) ;超聲波清洗機(jī)。
對(duì)照品:綠原酸(質(zhì)檢編號(hào):PS08072303)、咖啡酸(質(zhì)檢編號(hào):PS08092501)、木犀草苷(質(zhì)檢編號(hào):PS10052501)、異 綠 原 酸A(質(zhì) 檢 編 號(hào):PS100623-01)、異綠原酸B(質(zhì)檢編號(hào):PS100623-02)、異綠原酸C(質(zhì)檢編號(hào):PS100623-03) ，純度均大于98%，由成都普思生物科技有限公司提供。乙腈為色譜純(Fisher公司) ;甲酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司) ;超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備。金 銀 花、忍 冬老葉、忍冬新葉均采自河南省邢臺(tái)市巨鹿縣。
1．2對(duì)照品溶液的制備
分別稱取綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品10mg，用50%(v/v，下同)甲醇水溶液1.5mL溶解并定容;咖啡酸、蘆丁、木犀草素對(duì)照品10mg，用50%甲醇水溶液10mL溶解并定容;將溶解液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，得對(duì)照品溶液。
1．3供試品溶液的制備
稱取樣品粉末(60°C烘干24h，磨碎過(guò)40目篩)0.5g，加入50%甲醇水溶液10mL，稱定質(zhì)量;超聲提取1h，放冷，再稱定質(zhì)量，并用50%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量;搖勻，過(guò)濾，取濾液過(guò)0.45μm的有機(jī)濾膜，濾液供液相色譜測(cè)定。
1．4液相色譜條件色
譜柱:AgilentEclipsePlusC18(250mm×4.6mm，5μm) ;柱溫:20°C;進(jìn)樣量:10μL。流動(dòng)相:0.3%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。洗脫程序:0～25min，8%B;25～30min，8%B～19%B;30～60min，19%B。流速:1mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)切換程序:0～30min，330nm;30～40min，350nm;40～60min，330nm。
2結(jié)果與討論
2．1實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
為了使供試品溶液獲得*的提取率，采用50%甲醇水溶液對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取;將超聲時(shí)間設(shè)定為1h，以達(dá)到充分提取的效果。由于綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草素、異綠原酸的zui大吸收波長(zhǎng)不一致，如綠原酸在350nm處的吸收值是330nm處吸收值的一半，木犀草苷在330nm處的吸收值約比350nm處的吸收值低20%。為了提高方法的靈敏度，保證綠原酸和木犀草苷等目標(biāo)化合物都能在各自zui大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)，本文采用了帶有檢測(cè)波長(zhǎng)轉(zhuǎn)換程序的測(cè)定方法。由于綠原酸、咖啡酸及異綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為330nm，蘆 丁、木犀草苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，本文優(yōu)化得到了1.4節(jié)所述的檢測(cè)波長(zhǎng)切換程序。
2．2方法學(xué)的考察
2．2．1線性關(guān)系
取綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品溶液適量混合，得到一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)而稀釋得到不同梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取上述不同梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL進(jìn)樣分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。
2．2．2精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性
準(zhǔn)確吸取綠原酸、咖啡酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品混合溶液10μL，按照1.4節(jié)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3%(見(jiàn)表2) ，表明儀器精密度良好。
精密稱取同一批金銀花樣品粉末0.5g，共5份，按照1.3節(jié)方法制備供試品溶液，再按照1.4節(jié)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算得到各化合物峰面積的RSD為1.68%～3.15%(見(jiàn)表2) ，表明方法的重現(xiàn)性良好。
另精密稱取金銀花樣品0.5g，按照上述方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12h后進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算得到各化合物峰面積的RSD均小于3%(見(jiàn)表2) ，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2．2．3加標(biāo)回收率
精密稱取同一批金銀花樣品粉末5份，每 份0.5g，向已知含量的樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照以上方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按照以上色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算各個(gè)成分的回收率(見(jiàn)表3)。
2．3樣品含量的測(cè)定
采用上述建立的分析方法，對(duì)金銀花樣品進(jìn)行測(cè)定。表4結(jié)果表明，金銀花不同部位的有效成分含量存在差異。對(duì)于《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定的綠原酸、木犀草苷兩種有效成分，金銀花、忍冬老葉、忍冬新葉三者中含量差異顯著。新葉中綠原酸含量為2.572%，大于中國(guó)藥典中規(guī)定的1.5%;木犀草苷含量為1.498‰，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于中國(guó)藥典中規(guī)定的0.5‰。除此之外，作為金銀花有效成分的黃酮類物質(zhì)蘆丁，其在忍冬新葉中的含量為1.845‰，比在金銀花中的含量1.261‰高46.31%。忍 冬 老 葉中除咖啡酸、木犀草苷含量與金銀花中的含量差異不顯著外，其他各種有效成分含量均低于金銀花中的含量。忍冬不同部位有效成分總含量高低順序?yàn)?/span>:金銀花＞忍冬新葉＞忍冬老葉，差異顯著，但忍冬新葉總含量?jī)H比金銀花低6.92%，總含量成分接近，因此忍冬新葉有進(jìn)一步研究和開發(fā)的必要。圖1為金銀花、忍冬老葉、忍冬新葉和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖。
3結(jié)論
本文建立了同時(shí)測(cè)定忍冬中7種有效成分的液相色譜方法。該方法具有操作簡(jiǎn)單，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率高等特點(diǎn)。應(yīng)用該檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)忍冬新葉中綠原酸、木犀草苷含量均超過(guò)了《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī) 定 的 水 平，分 別為2.572%、1.498‰，且7種目標(biāo)成分的總含量?jī)H比金銀花低6.92%，證明忍冬葉中也含有大量的功能成分，有必要對(duì)忍冬葉進(jìn)行深入的研究和開發(fā)。本文為更好的評(píng)價(jià)忍冬品質(zhì)提供了更有效的方法。
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